生物信息

关于最新新冠病毒英国新变体VOC-202012/01的所有 2020年12月19日，英国首相约翰逊宣布，一种变异新冠病毒正在伦敦和英格兰东南部地区蔓延，传播速度比原先发现的病毒快70%。 这种SARS-CoV-2变体最初被Public Health England命名为VUI – 202012/01 (Variant Under Investigation)，随后被正式命名为VOC-202012/01 (Variant of Concern)。按照Pangolin对新冠病毒谱系命名规则，该变异体为B.1.1.7.。按照美国CDC采用的nextstrain命名方式为20I/501Y.V1.。 这种株系由17个突变定义，包括13个非同义突变，4个缺失，6个同义突变. gene nucleotide amino acid ORF1ab C3267T T1001I C5388A A1708D T6954C I2230T 11288-11296 deletion SGF 3675-3677 deletion spike 21765-21770 deletion HV 69-70 deletion 21991-21993 deletion Y144 deletion A23063T N501Y C23271A A570D C23604A P681H C23709T T716I T24506G S982A Read more…

bcftools是一组用于变异获取和操作VCF和BCF的实用工具集合。参数众多，功能也十分强大。 官方文档http://samtools.github.io/bcftools/bcftools.html 1、安装 下载地址 https://github.com/samtools/bcftools/releases/download/1.10.2/bcftools-1.10.2.tar.bz2 单独安装bcftools会要求安装各种环境，还比较容易报错，建议先安装htslib,然后再安装bcftools。 安装方法： 2、应用实例 1、将vcf文件压缩转换为vcf.gz 2、为vcf构建索引 3、去除vcf文件中所有的注释信息，只保留GT基因型数据 4、注释vcf中ID列，即rsid 5、对vcf文件进行排序 6、对vcf文件进行筛选 7、 对根据染色体分隔开的不同vcf文件进行合并 8、将vcf文件按照测序的样本分隔开 9、选取VCF中”CHROM、POS、ID、REF、ALT 、AC、AF 、GT”信息 10、根据”CHROM、POS”列表提取VCF文件对应位置信息 注意：每个子模块有各自的具体参数设置，按照自己需求进行调整。

Sequencing By Synthesis Priciple  在全外显子DNA文库Library制备完成并完成质检之后，就可以在illumina 测序仪上进行高通量测序了。illumina公司作为二代测序仪生产领先企业,自2006年进军基因测序市场以来,陆续发布了HiSeq，MiSeq，NextSeq，NovaSeq等一系列测序仪器。 illumina测序通过边合成边测序（SBS）的方法进行测序，核心是利用可逆终止的dNTP进行DNA延伸反应，通过四种碱基所发出不同荧光的颜色判读。 illumina测序准备 芯片Flowcell表面共价连接了两种DNA探针，与文库构建中DNA片段两侧加入的接头碱基互补，可以特异性地与之杂交结合。反复变性结合和PCR扩增，最终获得单条DNA链所产生的测序簇 ，用于扩大扫描时dNTP所产生的荧光信号。 1、双链DNA文库变性结合至flowcell表面 依据碱基互补配对原则，双链DNA文库变性退火后，片段根据两端接头随机地结合至Flowcell内表面上的单链DNA探针上。 2、桥式PCR扩增 已杂交至探针上的DNA文库片段另一侧接头结合至相邻的另一互补探针上，添加DNA聚合酶，dNTPs等进行PCR反应，类似于Bridge。 3、重复变性产生DNA簇 重复变性、洗脱PCR扩增后，最终形成单个DNA片段的DNA测序簇。 4、去除反义链 测序开始之前需要先将反义链去除，只剩正向DNA链进行测序。这一步可由特定的化学反应去除反向引物上的特定基团。 5、加入测序引物，边合成边测序 加入DNA聚合酶和带荧光标记的dNTP，并且其3’末端是被叠氮基所修饰，导致DNA聚合反应不能继续进行。只能利用化学反应消除该基团以便DNA聚合反应可以继续进行（可逆终止DNA聚合反应）。 每步反应结束后利用激光对flowcell表面进行扫描获得荧光信息。 6、双端测序PE 如有必要可以进行双端测序，具体即利用PCR反应合成反向链，然后用特定化学试剂去除正向链即可。原理一样。 7、结束之后，软件根据对应位置的荧光信号，给出DNA片段碱基信息（fastq文件）。 测序数据生物信息学分析

全外显子测序（Whole Exome Sequencing, WES）相比全基因组测序（Whole Genome Sequencing, WGS）更加经济,是一种广泛使用的靶向测序方法。外显子（人类基因组的蛋白质编码区）占基因组的不到2%，但含有约85%的已知疾病相关变异体，使整个外显子测序成为全基因组测序的一种经济有效的替代方法。外显子序列的使用外显子丰富可以有效地识别编码变体的广泛应用，包括群体遗传学，遗传病和癌症研究。 WES整个实验步骤分为全外显子文库构建，Cluster桥式PCR扩增，上机扫描测序，测序数据生物信息分析四个部分。 全外显子测序优势 广泛应用的突变识别 实现编码区域的全面覆盖 为全基因组测序提供了一种经济有效的替代方法（每个外显子的测序量为4-5GB，而整个人类基因组的测序量约为90GB） 与全基因组方法相比，生成更小、更易于管理的数据集，以便更快、更容易地进行分析 完整的实验流程 人类全外显子文库构建 整个文库构建流程如图所示，这是Illumina Nextera Rapid Capture Exome Kit的实验流程图。除此之外还可以选择Agilent SureSelect Human All Exon 等试剂盒，原理类似，大致流程分为：设计外显子区域以及5’3’UTR区域捕获探针，与打断后的150bp～200bp的DNA文库片段进行杂交，再利用探针上生物素与带有链霉亲和素的磁珠结合，通过富集磁珠间接地获得人类全外显子测序文库。 测序DNA根据建库方法要求不同，转座酶要求起始量为50ng以上，可由患者外周血或组织细胞提取获得。 把基因组DNA进行超声打碎100~200bp，或使用转座酶Tn5处理生成300bp片段建成DNA文库。 两端加接头P5，P7，index1，2。 选取合适长度DNA片段，并扩增纯化。 与带有生物素的外显子探针库进行杂交。 利用生物素biotin与链霉亲和素的强结合能力，将带有链霉亲和素的磁珠与已结合目标文库的探针结合起来。 吸附磁珠，去除上清液。 洗脱掉磁珠上的DNA，PCR扩增文库。 鉴定文库质量，准备上机测序。 illumina上机测序