全外显子测序WES实验流程-DNA文库构建

全外显子测序（Whole Exome Sequencing, WES）相比全基因组测序（Whole Genome Sequencing, WGS）更加经济,是一种广泛使用的靶向测序方法。外显子（人类基因组的蛋白质编码区）占基因组的不到2%，但含有约85%的已知疾病相关变异体，使整个外显子测序成为全基因组测序的一种经济有效的替代方法。外显子序列的使用外显子丰富可以有效地识别编码变体的广泛应用，包括群体遗传学，遗传病和癌症研究。

WES整个实验步骤分为全外显子文库构建，Cluster桥式PCR扩增，上机扫描测序，测序数据生物信息分析四个部分。

全外显子测序优势

• 广泛应用的突变识别
• 实现编码区域的全面覆盖
• 为全基因组测序提供了一种经济有效的替代方法（每个外显子的测序量为4-5GB，而整个人类基因组的测序量约为90GB）
• 与全基因组方法相比，生成更小、更易于管理的数据集，以便更快、更容易地进行分析

完整的实验流程

人类全外显子文库构建

整个文库构建流程如图所示，这是Illumina Nextera Rapid Capture Exome Kit的实验流程图。除此之外还可以选择Agilent SureSelect Human All Exon 等试剂盒，原理类似，大致流程分为：设计外显子区域以及5’3’UTR区域捕获探针，与打断后的150bp～200bp的DNA文库片段进行杂交，再利用探针上生物素与带有链霉亲和素的磁珠结合，通过富集磁珠间接地获得人类全外显子测序文库。

1. 测序DNA根据建库方法要求不同，转座酶要求起始量为50ng以上，可由患者外周血或组织细胞提取获得。
2. 把基因组DNA进行超声打碎100~200bp，或使用转座酶Tn5处理生成300bp片段建成DNA文库。
3. 两端加接头P5，P7，index1，2。
4. 选取合适长度DNA片段，并扩增纯化。
5. 与带有生物素的外显子探针库进行杂交。
6. 利用生物素biotin与链霉亲和素的强结合能力，将带有链霉亲和素的磁珠与已结合目标文库的探针结合起来。
7. 吸附磁珠，去除上清液。
8. 洗脱掉磁珠上的DNA，PCR扩增文库。
9. 鉴定文库质量，准备上机测序。

illumina上机测序