Sequencing By Synthesis Priciple
在全外显子DNA文库Library制备完成并完成质检之后，就可以在illumina 测序仪上进行高通量测序了。illumina公司作为二代测序仪生产领先企业,自2006年进军基因测序市场以来,陆续发布了HiSeq，MiSeq，NextSeq，NovaSeq等一系列测序仪器。
illumina测序通过边合成边测序（SBS）的方法进行测序，核心是利用可逆终止的dNTP进行DNA延伸反应，通过四种碱基所发出不同荧光的颜色判读。
illumina测序准备
芯片Flowcell表面共价连接了两种DNA探针，与文库构建中DNA片段两侧加入的接头碱基互补，可以特异性地与之杂交结合。反复变性结合和PCR扩增，最终获得单条DNA链所产生的测序簇 ，用于扩大扫描时dNTP所产生的荧光信号。
1、双链DNA文库变性结合至flowcell表面
依据碱基互补配对原则，双链DNA文库变性退火后，片段根据两端接头随机地结合至Flowcell内表面上的单链DNA探针上。
2、桥式PCR扩增
已杂交至探针上的DNA文库片段另一侧接头结合至相邻的另一互补探针上，添加DNA聚合酶，dNTPs等进行PCR反应，类似于Bridge。
3、重复变性产生DNA簇
重复变性、洗脱PCR扩增后，最终形成单个DNA片段的DNA测序簇。
4、去除反义链
测序开始之前需要先将反义链去除，只剩正向DNA链进行测序。这一步可由特定的化学反应去除反向引物上的特定基团。
5、加入测序引物，边合成边测序
加入DNA聚合酶和带荧光标记的dNTP，并且其3’末端是被叠氮基所修饰，导致DNA聚合反应不能继续进行。只能利用化学反应消除该基团以便DNA聚合反应可以继续进行（可逆终止DNA聚合反应）。
每步反应结束后利用激光对flowcell表面进行扫描获得荧光信息。
6、双端测序PE
如有必要可以进行双端测序，具体即利用PCR反应合成反向链，然后用特定化学试剂去除正向链即可。原理一样。
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